蛋白質樣本預備

蛋白質組學及代謝物組學設施 為生物樣本（如細胞、組織和體液）提供以下樣本準備服務：

1. 樣本均質化（例如細胞和組織）
2. 還原、烷基化、酶解（溶液內酶解或膠內酶解）及 C18 針尖微柱淨化
3. 去除高豐度蛋白質（Agilent MARS-14，適用於血清／血漿）
4. 相對與絕對定量同位素等重標記（iTRAQ）、TMT 標記用於蛋白質鑑定與定量
5. 使用超高效液相色譜（UPLC）進行多維蛋白質及肽段分離

請注意：

• 我們僅為 SILAC 標記的蛋白質樣本提供下游液相色譜－串聯質譜（LC-MS/MS）分析。
• PM Core 將根據項目需求決定選用的樣本準備服務

蛋白質酶解

膠內酶解配合考馬斯亮藍染色（Coomassie stained gels）效果最佳。如需更高靈敏度，亦可使用銀染或 Sypro Ruby 染色。進行銀染時，請務必使用兼容質譜分析的染色試劑盒。銀染膠點應以 1% 乙酸提交。考馬斯亮藍或 Sypro Ruby 染色膠點可以乾燥（脫水）狀態或脫色緩衝液形式提交（存放一段時間後可能會出現部分樣本損耗）。有關如何處理及提交樣本進行分析的詳細說明，請參閱樣本提交頁面。我們標準的膠內酶解及溶液內酶解方案包括半胱氨酸殘基的還原與烷基化，隨後使用胰蛋白酶（Trypsin）進行酶解。如需要，亦可進行替代酶解，請直接與我們聯絡以討論可用選項及收費。酶解完成後，樣本會使用 C18 微柱或離心過濾器進行純化及濃縮。

請透過電郵 pmcore.cpos@hku.hk 或致電 2831-5482 與 PM Core 聯絡，以諮詢哪種方法最適合您的研究，以及就您關心的化合物進行客製化質譜分析。收費和時間表將根據分析的複雜程度而有所不同。

蛋白質鑑定 – ESI-LC-MS/MS

工作流程

溶液內／膠內酶解
蛋白質樣本使用 Trypsin/Lys-C 或兩者進行酶解。

LC-MS/MS 分析
蛋白質鑑定是在與 Orbitrap Fusion Lumos 質譜儀聯用的線上反相納升液相色譜儀（on-line reverse-phase nanoLC）上進行。

資料庫搜尋
使用 SEQUEST 搜庫引擎對獲得的 MS/MS 質譜圖進行搜索，所得的蛋白質鑑定結果會使用 Proteome Discoverer (PD) 軟件進一步驗證。

在 PD 軟件中，會應用補充統計分析來進一步驗證肽段鑑定結果，並協助數據解讀過程。

結果交付
結果將以 PD 結果文件形式交付給用戶。

請在 Proteome Discoverer 軟件網站創建帳戶，以下載 PD 軟件的 30 天試用版。

透過檢視器，您將能夠存取為您的樣本獲取的所有原始 MS/MS 光譜，以及用於數據分析的所有參數報告，以供日後發表論文參考。

30 天後，試用版將僅用作輸出文件的檢視器。

發現型蛋白質組學

1. 同位素等重標記 — 同位素等重標記基於化學同位素摻入，使用具有相同化學結構和相同總質量的主標籤。在碎裂過程中釋放的標籤易斷裂部分（即報告離子）質量各不相同，相對定量則基於這些報告離子的強度。同位素等重標記方法支援多重樣品同時分析。包含 iTRAQ、串聯質譜標記 (TMT)、ICAT。
2. 細胞培養中氨基酸穩定同位素標記（SILAC）涉及透過使用包含 13C 或 15N 標記氨基酸的培養基來摻入同位素。相對定量基於輕標記和重標記肽段的強度。（請注意，我們不提供細胞培養服務，但可支援 SILAC 標記樣本的實驗設計和蛋白質組學分析）。SILAC
3. 無標記定量 — 該方法旨在測定兩個或多個生物樣本中蛋白質的相對含量。與其他蛋白質定量方法不同，無標記定量不使用含穩定同位素的化合物來化學結合並標記蛋白質。無標記定量可基於前體信號強度或光譜計數（Spectral Counting）。光譜計數基於以下假設：針對給定蛋白質鑑定出的 MS/MS 光譜數量與該蛋白質在樣本中的豐度成正比。光譜計數可用於獲得複雜樣本中蛋白質的相對定量，而無需進行標記。

請注意:

• 對於這些實驗，我們建議對每個生物學重複進行三次重複分析，以提高所測量肽段（及蛋白質）倍數變化（fold-changes）的統計顯著性。這類實驗可擴展至研究外部刺激或基因敲除等情況下隨時間變化的蛋白質表達。無標記差異表達僅適用於在 LC-MS/MS 前採用單維液相色譜分離的分析。
• 無論是標靶式（Targeted）還是全景式探索（Discovery）實驗，皆耗時且費力。這些方法的成功與否，取決於周詳的規劃以及選擇合適的樣本前處理技術。