蛋白質組學
樣本製備
蛋白質樣本預備
蛋白質組學及代謝物組學設施 為生物樣本（如細胞、組織和體液）提供以下樣本準備服務：
- 樣本均質化（例如細胞和組織）
- 還原、烷基化、酶解（溶液內酶解或膠內酶解）及 C18 針尖微柱淨化
- 去除高豐度蛋白質（Agilent MARS-14，適用於血清／血漿）
- 相對與絕對定量同位素等重標記（iTRAQ）、TMT 標記用於蛋白質鑑定與定量
- 使用超高效液相色譜（UPLC）進行多維蛋白質及肽段分離
請注意：
- 我們僅為 SILAC 標記的蛋白質樣本提供下游液相色譜－串聯質譜（LC-MS/MS）分析。
- PM Core 將根據項目需求決定選用的樣本準備服務
蛋白質酶解
膠內酶解配合考馬斯亮藍染色（Coomassie stained gels）效果最佳。如需更高靈敏度，亦可使用銀染或 Sypro Ruby 染色。進行銀染時，請務必使用兼容質譜分析的染色試劑盒。銀染膠點應以 1% 乙酸提交。考馬斯亮藍或 Sypro Ruby 染色膠點可以乾燥（脫水）狀態或脫色緩衝液形式提交（存放一段時間後可能會出現部分樣本損耗）。有關如何處理及提交樣本進行分析的詳細說明，請參閱樣本提交頁面。我們標準的膠內酶解及溶液內酶解方案包括半胱氨酸殘基的還原與烷基化，隨後使用胰蛋白酶（Trypsin）進行酶解。如需要，亦可進行替代酶解，請直接與我們聯絡以討論可用選項及收費。酶解完成後，樣本會使用 C18 微柱或離心過濾器進行純化及濃縮。
Please contact PM Core at pmcore.cpos@hku.hk or call 2185-5033 to consult which approach is compatible with for your research, and also for custom-made MS analyses for your compounds of interest. Pricing and scheduling will vary according to the complexity of analyses.
蛋白質鑑定 – ESI-LC-MS/MS
工作流程
溶液內／膠內酶解
蛋白質樣本使用 Trypsin/Lys-C 或兩者進行酶解。
LC-MS/MS 分析
蛋白質鑑定是在與 Orbitrap Fusion Lumos 質譜儀聯用的線上反相納升液相色譜儀（on-line reverse-phase nanoLC）上進行。
資料庫搜尋
使用 SEQUEST 搜庫引擎對獲得的 MS/MS 質譜圖進行搜索，所得的蛋白質鑑定結果會使用 Proteome Discoverer (PD) 軟件進一步驗證。
在 PD 軟件中，會應用補充統計分析來進一步驗證肽段鑑定結果，並協助數據解讀過程。
結果交付
結果將以 PD 結果文件形式交付給用戶。
請在 Proteome Discoverer 軟件網站創建帳戶，以下載 PD 軟件的 30 天試用版。
透過檢視器，您將能夠存取為您的樣本獲取的所有原始 MS/MS 光譜，以及用於數據分析的所有參數報告，以供日後發表論文參考。
30 天後，試用版將僅用作輸出文件的檢視器。
發現型蛋白質組學
- 同位素等重標記 — 同位素等重標記基於化學同位素摻入，使用具有相同化學結構和相同總質量的主標籤。在碎裂過程中釋放的標籤易斷裂部分（即報告離子）質量各不相同，相對定量則基於這些報告離子的強度。同位素等重標記方法支援多重樣品同時分析。包含 iTRAQ、串聯質譜標記 (TMT)、ICAT。
- 細胞培養中氨基酸穩定同位素標記（SILAC）涉及透過使用包含 13C 或 15N 標記氨基酸的培養基來摻入同位素。相對定量基於輕標記和重標記肽段的強度。（請注意，我們不提供細胞培養服務，但可支援 SILAC 標記樣本的實驗設計和蛋白質組學分析）。SILAC
- 無標記定量 — 該方法旨在測定兩個或多個生物樣本中蛋白質的相對含量。與其他蛋白質定量方法不同，無標記定量不使用含穩定同位素的化合物來化學結合並標記蛋白質。無標記定量可基於前體信號強度或光譜計數（Spectral Counting）。光譜計數基於以下假設：針對給定蛋白質鑑定出的 MS/MS 光譜數量與該蛋白質在樣本中的豐度成正比。光譜計數可用於獲得複雜樣本中蛋白質的相對定量，而無需進行標記。
請注意:
- 對於這些實驗，我們建議對每個生物學重複進行三次重複分析，以提高所測量肽段（及蛋白質）倍數變化（fold-changes）的統計顯著性。這類實驗可擴展至研究外部刺激或基因敲除等情況下隨時間變化的蛋白質表達。無標記差異表達僅適用於在 LC-MS/MS 前採用單維液相色譜分離的分析。
- 無論是標靶式（Targeted）還是全景式探索（Discovery）實驗，皆耗時且費力。這些方法的成功與否，取決於周詳的規劃以及選擇合適的樣本前處理技術。
蛋白質鑑定
非標靶蛋白質組學
定量磷酸化蛋白質組學
代謝物組學
標靶代謝物組學
我們為廣泛類別的代謝物提供基於質譜的標靶分析（詳細清單：在此下載）。
- 脂肪酸 (Fatty acids)
- 氨基酸及衍生物 (Amino acids and derivatives)
- 三羧酸循環及糖解中間物 (Tricarboxylic acids and Glycolysis intermediates)
- 磷酸戊糖途徑中間物 (Phosphate pentose pathway intermediates)
- 膽汁酸 (Bile acids)
- 類固醇 (Steroids)
- 神經遞質 (Neurotransmitters)
- 完整服務包括諮詢、樣本準備、基於氣相色譜－串聯質譜（GC-MS/MS）或液相色譜－串聯質譜（LC-MS/MS）的相對或絕對定量，以及數據分析。
- 樣本準備方案將根據樣本類型而定，詳情請瀏覽我們的 服務 -> 樣本要求與平台台應用。
- 我們亦為內部代謝物庫（Fiehn's metabolites，包含約 1400 種化合物）中的分析物提供標靶代謝物定量（在此下載).
- 對於上述內部庫以外的代謝物定量可能性，亦可與核心設施科學家另行討論。
請致電 2831-5486 或電郵 pmcore.cpos@hku.hk 與 PM Core 聯絡，以進行項目討論及索取服務報價。
標靶代謝物譜分析工作流程：
完整服務配套包括諮詢、樣本準備、LC 及／或 GC-MS/MS 運行及數據分析。
品質保證服務
質量控制：
- 我們應要求提供 QC 結果，以在項目樣本分析前展示 LC/GC 及 MS 性能。
- 我們在項目樣本運行之間運行 QC 樣本，以評估整體系統性能，確保數據質量符合發表論文的目的。
- 我們檢查標準校準曲線的標準，以確保其適合項目樣本定量。
- 我們檢查項目樣本的標準，以確保相對或絕對定量和確認有效。
| 注射類型 | 用途 | 標準 | 極限 |
| 標準 | 校準 | R2 | > 0.99 |
| 準確度 | +/- 30% | ||
| 項目樣本 | 定量 | % CV（技術重複） | < 20% |
| 信號 ／噪音 | > 10 | ||
| 確認 | 保留時間誤差（對照標準品） | < 0.2 分鐘 | |
| 離子比率誤差（對照標準品） | < 20% |
標準校準、樣本代謝物定量及確認的指標。根據分析物濃度等因素，可能會實施更嚴格的極限。
收費標準
點擊 按此 了解更多詳情。
樣本提交與要求
In order to ensure project success we offer consultation on project planning and experimental procedures best suitable to answer specific research questions using mass spectrometric methods on time-bound proteomics & metabolomics projects.
如需申請 HPCF2 用戶帳戶，請聯絡 PM core at 2185-5077 or pmcore.cpos@hku.hk for a project consultation, customised analyses and sample submissions.
蛋白質組學服務的樣本提交：
- 透過 iLab 提交服務請求
- 在將樣本帶到核心實驗室之前，請提前與我們的同事聯絡（透過電話／電郵）
- 填寫「ESI-LC-MS 蛋白質組學樣本提交表」（Orbitrap – Lumos 及 timsTOF） ，並將其作為附件上傳至 iLab 的服務請求中
- 將樣本帶到核心實驗室
代謝物組學服務的樣本提交：
- 透過 iLab 提交服務請求
- 在將樣本帶到核心實驗室之前，請提前與我們的同事聯絡（透過電話／電郵）
- 填寫「代謝物組學樣本提交表 ，並將其作為附件上傳至 iLab 的服務請求中
- 將樣本帶到核心實驗室
有關樣本提交與要求的常見問題，請參閱常見問題 (FAQ) 部分 。
PM Core 平台上各項應用的樣本要求如下表所示：
服務平台 應用 樣本類型 樣本製備 平台要求 Orbitrap Fusion Lumos
(LC-MS/MS)
timsTOF Pro
(LC-MS/MS) – 蛋白質鑑定
– 蛋白質定量 (DDA 或 DIA)
– 磷酸化位點鑑定與定量 組織 2 mg 乾重 50ng - 2µg 肽 (peptides) 血清或血漿 0.1 ml 細胞裂解物 < 1 million cells or 5-20 µg protein.
5µg purified protein for Phospho site ID.
1mg – 2mg protein per condition for Phosphoproteomics GC-QQQ MS 標靶代謝物定量 血清或血漿 每樣本 0.2 ml 代謝物濃度範圍：
pM – mM 組織 每樣本 20-50 mg 細胞裂解物 每樣本 300-600 萬個細胞 LC-QTRAP and LC-OE120 MS 標靶代謝物定量 血清或血漿 每樣本 0.2 ml 代謝物濃度範圍：
pM – mM 組織 每樣本 20-50 mg 細胞裂解物 每樣本 300-600 萬個細胞 試劑盒基於標靶代謝物譜分析 血清或血漿 每樣本 10 µl 細胞裂解物 每樣本 300 萬個細胞 Bio-HPLC 離線分級分離 (SCX、SAX、鹼性 RPLC) 從任何樣本類型中分離出的蛋白質 n/a 500µg – 5 mg
請注意:
- 未經事先諮詢，恕不接受樣本。具時間敏感性的項目將獲優先處理，包括及時提交資助申請所需的初步數據，以及重新提交手稿所需的額外實驗。
- 我們亦接收可直接上樣（ready to inject）的樣本進行 LC-MS/MS 分析。然而，在進行質譜分析之前，樣本必須不含鹽分、緩衝液和去污劑。所有其他樣本溶液條件必須在提交樣本前與員工討論。提供儘可能乾淨的樣本將大大提高我們為您提供最佳質譜數據的能力。
- 服務週期：通常為 15 – 40 個工作天，具體取決於項目詳情／服務性質。
聯絡我們
Dr SHARMA, Rakesh
Dr LAM, Ronald
