Sanger 測序

技術概覽

Applied Biosystems (ABI) 3730xl DNA 分析儀

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請透過 iLab 提交服務申請。

製備 DNA

質粒 DNA

質粒 DNA 應不含基因組 DNA、RNA 及其他雜質。

可使用各種標準質粒純化方法。

市售質粒純化試劑盒（基於離心柱）通常效果良好。

PCR 產物

PCR 產物必須純淨且為單一特定序列，方能獲得清晰無誤的測序讀段。

為獲得最佳結果，在將 PCR 產物用作測序的模板 DNA 之前，應去除引物、引物二聚體和 dNTP。可使用不同方法進行此類淨化：

*檢查所用離心柱的淨化大小截斷值。

不建議使用任何帶顏色的 PCR 預混試劑，因為染料可能會影響測序結果。

DNA 質量控制

可透過使用適當 DNA 質量標記的瓊脂糖凝膠電泳來檢查 DNA 質量和數量。

質粒 DNA 和純化 PCR 產物的濃度可透過紫外分光光度計（例如 Nanodrop）或基於螢光的方法（例如 Picogreen 或 Qubit）測定。A260/280 比率 >1.8~2 反映為純淨 DNA。

引物、引物二聚體和 dNTP 會對 A260 讀數造成影響，因此含有此類污染物的 PCR 產物濃度在使用紫外分光光度計（例如 Nanodrop）測定時會被高估。

DNA 模板與測序引物預先混合指南

DNA 模板與測序引物必須在提交測序前進行混合（預混）。

準備15 µL的預混液以供提交，程序如下：

* 以下的指引列出模板 DNA 的適當數量：


樣本類型		在 15 µL 樣本中的總 DNA 數量 (ng)	在 15 µL 樣本中的 DNA 濃度 (ng/µL)
PCR Product	100 - 200bp	1 - 3	0.07 – 0.20
	200 - 500bp	3 - 10	0.20 – 0.67
	500 - 1000bp	5 - 20	0.33 – 1.33
	1000 - 2000bp	10 - 40	0.67 – 2.67
	> 2000bp	20 - 50	1.33 – 3.33
ssDNA		25 - 50	1.67 – 3.33
dsDNA, Plasmid		150 - 300	10.00 – 20.00
Cosmid, BAC		500 - 1000	33.33 – 66.67
細菌基因組 DNA (Bacterial genomic DNA)		2000 - 3000	133.33 – 200.00

不建議在預混液中使用 TE 或其他含 EDTA 的緩衝液，同時避免添加任何二價陽離子，如 ^Mg2+、Ca²⁺ 及 Mn²⁺ 等。

*提交模板-引物預混液或完成的循環測序產物的用戶，應優化模板/引物比例或循環測序反應條件，這取決於模板大小/含量及引物結合效率。

若因模板/引物比例欠佳或循環測序條件不當而導致測序失敗，CPOS 概不負責。

將會採用以下標準循環測序程序：

純化與毛細管電泳

提交 20 µL 的循環測序反應產物。體積可用無 DNase 水補足。

最終體積必須為 20 µL，否則樣本將被拒絕接受。請保護循環測序產物免受光照。

樣本提交格式

為確保樣本處理高效及服務迅速，樣本必須使用指定的容器類型提交。


樣本數量	容器類型
1 to 7	200 µL 微量離心管
8 to 32	帶蓋的8聯管
33 to 90	96 孔反應板* （按直行排列樣本，即由 A1 至 H1 順序向下填滿，然後至 A2 至 H2，如此類推）預留 6 個空白孔作內部實驗對照（請參考 Sanger 樣本提交表格）。如使用速遞服務（僅限本地非港大學術用戶），反應板必須使用排蓋緊密密封；如親身遞交反應板且保持不倒置，使用品質良好的黏貼封膜亦可。

請遵循上述格式，並清晰標籤試管／條管／盤。

樣本提交步驟

請參閱「用戶如何提出服務申請（Sanger 測序）」一節了解更多資訊。

根據上述容器類型準備樣本。
透過 iLab 提交服務申請。
填妥 Sanger Sample Submission Form.
- 每盤使用一份表格
- 清晰填寫所有資訊，否則工作將會延誤
- 數據質量控制需要每個樣本的預期讀段長度
透過 iLab 以附件形式提交 Sanger 樣本提交表格。
將樣本提交至設施，並將填妥的 Sanger 樣本提交表格紙本釘在塑膠袋外側。