技術概覽
10X Genomics 技術將單細胞包裹到凝膠珠乳液 (GEMs) 中。
從單個細胞生成的 cDNA 將進行文庫製備與二代測序 (NGS)，以揭示單細胞水平上的基因表達譜。
我們的設施現已配備 Chromium iX 儀器。歡迎隨時聯絡我們了解服務詳情。
收費標準與訂購
單細胞 3′ 基因表達分析
- 每個樣本 500 – 20,000 個細胞的 3′ 端基因表達分析
單細胞 5′ 基因表達與免疫譜分析
- 每個樣本 500 – 20,000 個細胞的 5′ 端基因表達分析
- 組裝、註釋全長 T 細胞及／或 B 細胞 V(D)J 序列並識別基因克隆型 (clonotypes)
- 能夠從同一個樣本中檢查基因表達譜並解析 TCR/BCR 譜系
單細胞基因表達測定附加 Feature Barcode 技術
- 透過同時測量同一個細胞的細胞表面蛋白表達或 CRISPR 干擾，實現多組學分析
單細胞多組學
ATAC + 基因表達
- 從同一個細胞核中對轉錄組（3’ 基因表達）和開放染色質（ATAC-seq）進行多組學分析，每個樣本最多可達 10,000 個細胞核
單細胞基因表達 Flex
- 使用針對人類或小鼠轉錄組的探針分析固定樣本的轉錄組
- 兼容細胞懸浮液、新鮮或冷凍組織
- 單次反應最多可進行 16 個樣本的多重檢測 (multiplex)
- 每個樣本目標高達 20,000 個細胞
各項測定可用的附加應用：
| 單細胞 3′ 基因表達分析 | 單細胞 5′ 基因表達與免疫譜分析 | 單細胞多組學 ATAC + 基因表達 | 單細胞基因表達 Flex | |
| V(D)J 測序 | √ | |||
| 細胞表面蛋白 | √ | √ | √ | |
| CRISPR 篩選 | √ | √ | ||
| 樣本多重檢測 (Sample Multiplexing) | √ |
服務價格
本設施提供完整服務，包括使用 10X Chromium iX 進行細胞包裹、隨後的文庫製備、Illumina 測序到透過 Cell Ranger 進行數據分析。請聯絡 Dr. KWOK, Hin (singlecell10x.cpos@hku.hk / 2831-5483) 進行項目討論及索取服務報價。
價格會因下列因素而異：
- 每次提交的樣本數量
- 應用（例如 3′ 基因表達、5′ 基因表達、V(D)J 分析等）
- 目標細胞數量（影響測序成本）
- 生物訊息學分析需求
- 隸屬單位（香港大學、本地學術機構、海外學術機構等）
服務訂購
請參閱「樣本要求與提交」一節了解樣本要求。
請透過 iLab 提交服務申請。
技術詳請
Chromium 單細胞包裹與文庫預備
在 3′ 或 5′ 基因表達測定中，細胞將由 10X Chromium iX 包裹到凝膠珠乳液 (GEMs) 中，隨後進行逆轉錄和文庫製備，成為一組 cDNA 文庫。來自同一個細胞的轉錄本將由 10X 條形碼識別，而這些轉錄本中的每一個都可以透過獨特分子標籤 (UMI) 互相區分。
資料來源：10X Genomics
對於 Multiome 測定，細胞核將首先進行轉座 (transposition)，其中轉座酶進入細胞核並優先片段化染色質開放區域中的 DNA。轉座後的細胞核將按照上述類似程序進行包裹，以生成基因表達以及 ATAC 文庫。
對於 Flex 測定，樣本需要用甲醛固定，然後與全轉錄組探針孵育以捕獲 mRNA 轉錄本。雜交後，最多可將 16 個樣本合併到一個反應中進行隨後的包裹和文庫製備。除了用於識別每個單細胞的細胞條形碼外，還存在探針條形碼 (probe barcodes) 以將細胞分配到每個樣本中。
測序運行
所生成的文庫與 Illumina 測序儀兼容。為了在一端讀取轉錄本序列，並在另一端讀取條形碼和 UMI，需要進行雙端測序 (paired-end sequencing reads)。
請參閱下表了解供應商對每項應用所需的最低測序深度的建議。
| 應用 | 3’, 5’ 或 Multiome 基因表達文庫 | V(D)J 文庫 | Feature Barcode 文庫 | Multiome ATAC 文庫 | 基因表達 Flex 文庫 |
| 每個細胞／細胞核的雙端讀段數 | 20,000 | 5,000 | 5,000 | 25,000 | 10,000 |
| CPOS 運行設定 | NovaSeq X Plus PE150bp | NovaSeq X Plus PE150bp | NovaSeq X Plus PE150bp | NovaSeq X Plus PE50bp （由於屬於自定義運行循環，用戶須單獨包槽該次測序） | NovaSeq X Plus PE150bp |
工作流程
樣本規格與提交
樣本要求
請參閱下表了解各項應用的樣本提交要求：
| 應用 | 3' 或 5' 基因表達 | Multiome ATAC 和 基因表達 | 基因表達 Flex |
| 樣本類型 | 單細胞／細胞核懸浮液 | 單細胞核懸浮液 | 固定細胞／細胞核懸浮液 |
| 細胞大小 | 30 µm 或以下，充分解離，無團塊或雙細胞(doublets) | ||
| 濃度 | 500 – 2,000 細胞／μl， 最少 50 μl | 3,000 – 8,000 細胞核／μl， 最少 10 μl | 濃度不限。 請準備 >100,000 個固定細胞／細胞核。 |
| 存活率 | 細胞：≥85% 細胞核： <5% | <5% | N/A |
| 樣本緩衝液 | 建議使用 1× PBS 配搭 0.04% BSA（或供應商建議的其他緩衝液） 避免使用過量的 EDTA（>0.1 mM）或鎂離子（>3 mM），以及任何界面活性劑（例如 Tween-20 等）。 | 含 RNase 抑制劑的 Diluted Nuclei Buffer。 Nuclei Buffer (10X Genomics) 的儲備液將由 CPOS 提供。 | Quenching Buffer (10X Genomics) 或 Tissue Resuspension Buffer |
| 樣本預備指南 | 請按此 | 請按此 | 請按此 |
| 樣本提交表格 | 請按此 | 請按此 | 請按此 |
樣本提交
由於項目性質所限，樣本必須在提交後立即處理。請提前聯絡我們的同事（透過此處顯示的電話／電郵）以預約時段。
確認樣本提交日期及詳情後，請透過 iLab 提交服務申請。請提交單細胞（10X Genomics）樣本提交表格作為 iLab 的附件。
服務條款
由於技術限制，包裹過程中可能會偶爾發生浸潤失敗 (wetting failure) 或堵塞，導致反應無法使用。CPOS 無法保證每個樣本都能成功包裹。我們將盡力為用戶產出最佳輸出與高質量數據。如實驗失敗，我們將立即聯絡用戶商討後續處理方式。
完整服務的預期服務週期通常為從樣本提交到測序數據交付的 2 至 4 個星期。服務週期可能會因案件需求量而異。
聯絡我們
Dr KWOK, Hin
Ms CHENG, Lilian
