技術概覽
Illumina 測序是全球最為廣泛使用的大規模並行測序 (MPS)／二代測序 (NGS) 技術。這是一種基於合成測序 (SBS) 化學原理的高通量 DNA 測序方法。它涉及使用橋式 PCR 在流動槽 (flow-cell) 上對文庫進行克隆擴增，並支持單端讀取 (single read) 或雙端讀取 (paired-end read)。帶有索引的接頭 (adapters) 允許在流動槽的單個泳道 (lane) 上進行多重測序，從而實現省時且具成本效益的測序運行。該技術為基因組學、轉錄組學和表觀基因組學研究提供了廣泛的應用。
基因組學設施現已配備一台 NovaSeq X Plus 和一台 NovaSeq 6000 測序儀，兩台測序儀均為先進的 Illumina 平台，旨在提供空前的通量與可擴展性。NovaSeq X Plus 以更高的速度和成本效益提供超高數據輸出，非常適合大規模的項目。此外，我們還擁有 MiSeq 測序儀，支持需要快速交付數據或較長測序讀取長度的小規模項目。憑藉最新的硬件和軟件配置，MiSeq 支持從 SE36 (1 x 36 bp) 到 PE300 (2 x 300 bp) 的各種讀取長度。請聯絡我們了解詳情。
本設施提供 Illumina 測序的完整服務，包括文庫製備和測序運行。亦提供預製文庫的測序運行服務。歡迎查詢。
應用：
下表總結了自 2012 年 4 月起在本設施完成的服務。
| 樣本類型 | 服務類型 |
| DNA | 全基因組測序、人類外顯子組測序、標靶富集測序、擴增子測序、宏基因組學測序、ChIP-seq、甲基化測序、16S rRNA 測序及其他 |
| RNA | 轉錄組測序、小片段RNA 分析及其他 |
收費標準與訂購
收費標準
本設施提供全面的二代測序 (NGS) 服務，包括核酸提取、文庫製備、NovaSeq/MiSeq 測序及生物資訊學服務。
請聯絡郭博士 (hinkwok.cpos@hku.hk / 2831-5483) 或平台專家進行項目討論。
價格會因下列因素而異：
- 所需的數據產出或基因組覆蓋度／測序深度（測序讀段或鹼基產出）
- 讀取類型和長度（單端讀取或雙端讀取，50 bp 至 300 bp）
- 工作類型（DNA 霰彈槍法測序、RNA-seq、小 片段RNA-seq、ChIP-seq、宏基因組學等）
- 樣本數量
- 樣本的 GC 含量
- 測序文庫構建方法
- 生物訊息學分析需求
- 特殊及／或額外要求
- 所屬機構（香港大學、本地學術機構、海外學術機構及商業公司）
服務訂購
請透過 iLab 提交服務申請。
技術詳請
測序文庫構建
提供不同的文庫製備選項。根據應用需求，本設施可提供多達 384 種索引組合 [1]用於文庫構建和測序。我們為項目討論提供免費諮詢。請聯絡我們以了解更多資訊。
[1] 提供帶有獨特分子標籤 (UMI) 的獨特雙索引 (Unique Dual Indices)。歡迎查詢。
測序運行
NovaSeq 6000 規格（來自 Illumina）：
| 讀取長度 | SP Flow Cell | S1 Flow Cell | S2 Flow Cell | S4 Flow Cell | ||
| 單通道流動槽 | 單通道流動槽 | 單通道流動槽 | 單條道 | 單通道流動槽 (4 通道) | ||
| 2 x 50 bp ^ | 65 – 80 Gb | 134 – 167 Gb | 333 – 417 Gb | n/a | n/a | |
| 2 x 100 bp ^ | 134 – 167 Gb | 266 – 333 Gb | 667 – 833 Gb | 400 – 500 Gb | 1600 – 2000 Gb | |
| 2 x 150 bp | 200 – 250 Gb | 400 – 500 Gb | 1000 – 1250 Gb | 600 – 750 Gb | 2400 – 3000 Gb | |
| 通過過濾讀段 (Reads Passing Filter) | 單端讀段 | 650 – 800 M | 1.3 – 1.6 B | 3.3 – 4.1 B | 2.0 – 2.5 B | 8.0 – 10.0 B |
| 雙端讀段 | 1.3 – 1.6 B | 2.6 – 3.2 B | 6.6 – 8.2 B | 4.0 – 5.0 B | 16.0 – 20.0 B | |
| 質量分數 * (v1.5 試劑套件) | 在 2x 50 bp 讀長下，≥ 90% 的鹼基大於 Q30 | |||||
| 在 2x 100 bp 讀長下，≥ 85% 的鹼基大於 Q30 | ||||||
| 在 2x 150 bp 讀長下，≥ 85% 的鹼基大於 Q30 |
NovaSeq X Plus 規格（來自 Illumina）：
| 讀取長度 | 1.5B 流動槽 | 10B 流動槽 | 25B 流動槽 | |||
| 單通道流動槽 | 單條道 | 單通道流動槽 (8 通道) | 單條道 | 單通道流動槽 (8 通道) | ||
| 2 x 50 bp ^ | 165 Gb | 125 Gb | 1 Tb | 325 Gb | 2.6 Tb | |
| 2 x 100 bp ^ | 330 Gb | 250 Gb | 2 Tb | 660 Gb | 5.3 Tb | |
| 2 x 150 bp | 500 Gb | 375 Gb | 3 Tb | 1 Tb | 8 Tb | |
| 通過過濾讀段 (Reads Passing Filter) | 單端讀段 | 1.6 B | 1.25 B | 10 B | 3.25 B | 26 B |
| 雙端讀段 | 3.2 B | 2.5 B | 20 B | 6.5 B | 52 B | |
| 質量分數 * | 在 2x 50 bp 讀長下，≥ 90% 的鹼基大於 Q30 | |||||
| 在 2x 100 bp 讀長下，≥ 85% 的鹼基大於 Q30 | ||||||
| 在 2x 150 bp 讀長下，≥ 85% 的鹼基大於 Q30 |
MiSeq 規格 (from Illumina):
| 讀取長度 | MiSeq 試劑套件版本 | 輸出 | 通過過濾讀段 (Reads Passing Filter) | 質量* |
| 2 x 250 bp | v2 | 7.5 – 8.5 Gb | 2,400 萬至 3,000 萬雙端讀段 | 大於 75% 的鹼基大於 Q30 |
| 2 x 300 bp | v3 | 13.2 – 15 Gb | 4,400 萬至 5,000 萬雙端讀段 | 大於 70% 的鹼基大於 Q30 |
^本設施常規運行讀取長度為 2 x 150bp 的 NovaSeq。如需其他讀取長度，請查詢。
*Illumina PhiX 對照文庫的表現及定序結果可能會因樣本質量、核苷酸多樣性、叢集密度和其他實驗因素而異。即使摻入多量的 Illumina PhiX，測序結果無法保證低多樣性文庫的 Q30 和質量。
工作流程
樣本規格與提交
A. 樣本製備
純淨的 DNA 和 RNA 對確保一致的文庫製備和高質量數據至關重要。
我們的建議如下：
- 使用離心柱純化 (column purification)
- 對於採用苯酚／氯仿方法純化的樣本，應用離心柱重新純化
- 以 RNase 處理 DNA
- 用 DNase 處理 RNA
一般而言，樣本應符合以下條件：
- 不含抑制劑，例如血紅素（來自血液）、EDTA 及鹽類
- 不含有機溶劑，例如苯酚、氯仿及乙醇
- 不含細胞碎片或蛋白質
- 溶解於適當 pH 值的緩衝液中，例如 pH 8.5 的 10 mM Tris-HCl
- 未降解，即高分子量、雙鏈基因組 DNA 以及高 RQN 分數的 RNA
備註：對於使用 Illumina Nextera 試劑盒的項目，請確保初始 DNA 不含 EDTA，且不含苯酚和乙醇等有機污染物。這些物質會干擾 Nextera 標籤化 (tagmentation) 反應並導致測定失敗。
在進行樣本製備之前，請聯絡平台專家以確認樣本提交物流。
B. 樣本要求
在提交樣本之前，應使用紫外分光光度法評估 DNA 和 RNA 的純度與數量估算。某些基於 DNA 的應用亦需要凝膠照片。
提交樣本後，本設施平台專家將進行樣本質量控制 (QC)，其中包括：
- 用於 DNA 和 RNA 樣本的 Qubit 定量
- 用於 RNA 樣本的 Fragment Analyzer RNA 質量評估（按成本收費）
請參閱下表了解各項應用的樣本提交要求，請將樣本以最低體積 10 µL 盛載於標籤清晰的 1.5 mL 低吸附微量離心管中。
| 測序類型 | 樣本類型 | 輸入標準操作流程 (基於 Qubit 測值) | CPOS 基因組學設施 所要求的最低數量* | 濃度 | A260/280 | RQN^ | 是否需要電泳膠片 |
| DNA 定序 | DNA | 1 ng – 1 μg | 200 ng – 1.5 μg | >50 ng/μL | 1.8 – 2.0 | n/a | Y |
| 人類全外顯子定序 (WES) | 基因組 DNA | 0.5 – 1 μg | 1.5 μg | >50 ng/μL | 1.8 – 2.0 | n/a | Y |
| 染色質免疫沉澱定序 (ChIP-Seq) | ChIP-DNA | 1 ng – 10 ng | 40 ng | >5 ng/μL | n/a | n/a | Y |
| 人類全基因組定序 (WGS) | 基因組 DNA | 550 ng | 1.5 μg | >60 ng/uL | 1.7 – 2.0 | n/a | Y |
| 全基因組甲基化定序 (WGMS) | 基因組 DNA | 50 – 100 ng | 150 ng | >2 ng/uL | 1.7 – 2.0 | n/a | Y |
| 游離 DNA | 1 – 20 ng | 4 ng | >0.2 ng/uL | 1.7 – 2.0 | N | ||
| FFPE DNA | 40 ng | 100 ng | >1 ng/uL | n/a | N | ||
| Whole Genome Bisulfite-Seq (WGBS) | 基因組 DNA | 250 ng | 1.5 μg | >50 ng/uL | 1.8 – 2.0 | n/a | Y |
| 降解代表性重亞硫酸鹽定序 (RRBS) | 基因組 DNA | 100 ng | 500 ng | >50 ng/uL | 1.8 – 2.0 | n/a | Y |
| 去核醣體核糖核酸定序 (rRNA-depleted RNA-Seq) | 總 RNA | 100 ng – 500 ng | 300 ng | >30 ng/μL | 1.8 – 2.2 | >=7 | N |
| Poly-A mRNA 定序 (Poly-A mRNA-Seq) | 總 RNA | 100 ng – 1 μg | 300 ng | >30 ng/μL | 1.8 – 2.2 | >=7 | N |
| 小型 RNA 定序 / microRNA 定序 (Small RNA-Seq / miRNA-Seq) | 總 RNA | 100 ng – 500 ng | 300 ng | >30 ng/μL | 1.8 – 2.2 | >=7 | N |
* 我們要求高於方案投入量的原因有二：
(1) 我們需要在文庫構建前預留額外樣本用於樣本 QC。
(2) 我們注意到大多數用戶使用 O.D. 測量（例如 Nanodrop）對樣本進行定量，在大多數情況下這會高估 DNA/RNA 的數量。
^對於 RQN 低於 7 的 RNA 樣本，儘管質量較低，我們以往仍有成功構建測序文庫的經驗。在此情況下，我們將向您提供如何進一步推進以優化結果的建議。
我們會妥善保存樣本並歸還任何剩餘樣本。
如果您的樣本不符合上述要求，請聯絡我們，我們可共同尋求替代方案。
C. 樣本提交
如需申請服務，請使用 iLab 並確保上傳與該應用相應的已填妥樣本提交表格。
- 對於 SS100 服務（DNA-Seq 項目）：Sample-Submission-Form-SS100（並將帶有適當大小標記的 DNA 凝膠照片附加到iLab 作業中）
- 對於 SS300 服務（RNA-Seq 項目）：Sample-Submission-Form-SS300
- 對於其他 NGS 服務： Sample-Submission-Form
Please contact our colleagues in advance (via phone/email) prior to your on-site sample submission.
我們鼓勵用戶提交單管預先混合的文庫 (pre-pooled libraries) 用於測序服務。每支提交的文庫或文庫混合物管均須由本設施進行文庫 QC。這包括用於定量的 Qubit 和 qPCR，以及用於大小 QC 的 Fragment Analyzer。
索引資訊應在提交文庫前發送至本設施。請提供正向鏈方向的 i5 索引序列（如有）。以下是使用 BLAST 搜索檢查索引序列方向的指南。
重要提示：提供錯誤的索引序列可能會導致多工解訊/樣本分流 (demultiplexing) 失敗，並可能影響共享同一測序泳道的其他文庫的讀取分配。在這些情況下可能會產生額外費用。
每支預製文庫管的一般提交要求：
| 測序平台 | NovaSeq X Plus | MiSeq |
| 文庫濃度 (ng/µL) （透過 Qubit 測定估算） | ≥ 2.5 | ≥ 2 |
| 文庫濃度 (nM) （透過 QPCR 測定估算） | ≥ 5 | ≥ 5 |
| 體積 (µL) | 對 20-400 Gb 的服務：≥ 15 µL 對超過 400 Gb 的服務：≥ 20 µL | ≥ 20 |
- 最佳文庫大小為 200 – 800 bp。
- 無色，以 1.5mL 微量離心管交付。
- 零接頭二聚體 (adapter dimer) 污染。
- 所需的實際體積可能取決於運行類型。對於難以滿足上述要求的文庫，請向我們查詢。
在 iLab 中附加以下資訊：
- 文庫提交表格 (Excel 格式)
- 官方文庫製備方案
- 索引 i7 和 i5 序列
- 帶有完整接頭序列的索引 i7 和 i5 序列（若使用自定義方案或自定義訂購的接頭寡核苷酸）)
提交前請諮詢平台專員。
數據收集
概覽
數據備妥後，將透過電郵通知用戶。關於數據存放位置的詳情，請參閱 CPOS 生物資訊學設施網頁。
服務條款
數據產出
請參閱「技術詳情」了解相關資訊。
然而，實際通量會因下列因素而異：
- 叢集密度 (Cluster Density)
- 樣本的 GC 含量
- 試劑批次
- 測序批次間差異
數據質量與可用性
我們將秉持誠信，為所有合作者和用戶產出最佳的產出與高質量數據。
任何問題都將在運行前、運行中和運行後公開討論。
各個步驟的資料亦可應要求提供予合作者及用戶。
周轉時間
| NovaSeq X Plus | MiSeq | ||
全方位服務：
| 2-4 星期 | 全方位服務：
| 2-3 星期 |
| 3-5 星期 | ||
| 每條定序道獨立定序服務 (每條定序道／每個 flow cell） 僅定序服務 (Consolidated Sequencing-Only Service) (與其他專案混合定序池) | 1-3 星期 1-3 星期 | Sequencing-only service * (per flow cell) | 1-2 星期 |
周轉時間從樣本通過我們的 QC 標準起計算，至結果交付時止。
Turnaround Time is valid for project size <= 80 samples. Please contact us for service TAT info if project size >80 samples.
周轉時間在現貨試劑可用時有效，否則需要額外數週時間訂購和交付試劑。
CPOS 樂意協助研究人員進行研發項目及應對緊急需求，歡迎隨時與我們討論您的計劃。
* * 對於 MiSeq 測序運行服務，默認情況下不會選擇接頭剪切 (Adapter Trimming)。如果您需要接頭剪切，請在項目確認前明確指定。
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